材料

C16000 全自動(dòng)生化檢測儀(雅培公司)； AVANTI J-26 XP 離心機(jī)(美國 Bechmen 公司)； LRH-150 37 ℃恒溫孵育箱(上海齊欣有限公司)； Multiskan FC 酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；NIKON ECLIPSE TI-SR 倒置熒光顯微鏡、NIKON DS-U3 成像系統(tǒng)均來自日本尼康 NIKON；Mastercycler Pro PCR 儀、Mastercycler Pro 冷凍離心機(jī)均來自德 國 Eppendorf；CFX-96 touch 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 (美國 Bio-Rad)；UV-2550 紫外分光光度計(jì)(蘇州島 津公司)；Micro17R 低溫高速離心機(jī)(Thermo)；VE 180C 電泳儀電泳槽、VE186 轉(zhuǎn)膜儀均來自天能。金黃地鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，測定各項(xiàng)血脂 指標(biāo)，篩選接近正常血脂水平的金黃地鼠，隨機(jī) 分為 6 組，每組 8 只。正常組、模型組分別給予 生理鹽水；PTFC 低、中、高劑量組分別給予 25， 50，100 mg?kg–1 PTFC；陽性對(duì)照非諾貝特組給予 100 mg?kg–1 非諾貝特。PTFC 給藥劑量參照前期已 發(fā)表研究。

方法

采用 Western blotting 檢測高脂血癥金黃地鼠 肝臟、脂肪、骨骼肌中 PPAR-α、PPAR-γ 的蛋白表 達(dá)水平。將金黃地鼠肝臟、骨骼肌和脂肪分別每 份樣品加入 1 000 μL 的 RIPA 裂解液(含 PMSF 和 蛋白酶抑制劑)，采用手動(dòng)勻漿器研磨。置于冰上 裂解 30 min；12 000 r·min?1 離心 5 min，取上清。 BCA 試劑盒測定總蛋白濃度。隨后取適量樣品置 于 SDS-PAGE 凝膠中電泳，隨后轉(zhuǎn)入 PVDF 膜， TBST 洗膜 10 min×3 次后加入含 5%脫脂奶粉的封 閉液，搖床振蕩 1.5~2 h。封閉結(jié)束后 TBST 洗膜 10 min×3 次，而后將放入加入對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液 中，4 ℃搖床振蕩孵育過夜。第 2 天 TBST 洗膜， 用 5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩 反應(yīng) 1~2 h。TBST 洗膜 5~10 min×3 次后在暗室 中用 X 膠片感光、顯影、定影，Image J 軟件計(jì) 算條帶的表達(dá)強(qiáng)度。

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